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基于试纸的埃博拉病毒RNA检测

发布时间:2017-05-11

核酸检测是能够早期诊断传染病的最成功的技术。由于其高度的技术性和成本,核酸扩增试验(NAAT)仅对发展中国家人口的一小部分有益。通过降低成本,简化程序并实现多路复用,纸张微流体有可能大大方便最广大的需求人群。然而,在这方面进行的大多数研究还处于实验室技术验证。将NAAT放在试纸上更能够接近检验场景,从而使用临床样本并在资源有限的环境中高效检测。

非洲最近的埃博拉爆发事件造成11000多人死亡,突显了早期诊断疾病的重要性,以及及时采取卫生措施,如隔离和治疗,尽量减少感染风险的必要性。鉴于症状发作后第一个小时内感染检测的唯一方法是基于分子生物学的核酸检测方法,因为与NAAT(核酸扩增试验)相比,抗原检测试验较不敏感,存在很多特异性。具体而言,在感染后,病毒RNA水平会呈现对数增加,达到10的4-6次方个拷贝,对于核酸检测技术而言是非常有利的。

在一个新研究中,研究人员首先使用纸微流体装置进行埃博拉病毒合成核糖核酸(RNA)的等温逆转录和重组酶聚合酶扩增(RT-RPA),并进一步应用这种方法在非洲国家几内亚分析人类来源的RNA样本,来检测埃博拉病毒。RT-RPA结果在几分钟内可用,与一组43例患者样品的标准逆转录RT-PCR相比,其灵敏度为90.0%。此外,研究人员还实现了三个不同RNA序列的并行检测,打开了检测多种病毒株或病原体的技术大门。

在埃博拉病毒爆发期间,通过标准方法检测RNA病毒进行诊断测试,从RNA病毒样本中提取RNA,随后进行逆转录(RT)和PCR(实时聚合酶链式反应),扩增病毒基因组并鉴定该病毒的存在。这代表了重要的信息,但是利用现有技术,RT-PCR具有很长的时间,而且设备昂贵,具备相应技术的实验人员有限。在有限的资源国家,如利比里亚,几内亚和塞拉利昂,这些资源很少。非政府组织和世界卫生组织的国际援助使得在若干受影响地区实施了埃博拉治疗中心和诊断实验室,但是全球对疫情规模的认识的拖延导致疫情延迟和大规模扩散。

从这个角度来看,纸微流体代表了一种有希望的技术。纸微流体采用纸作为在复杂网络管理流体中的固体基质,是一种用户友好、低成本的技术。直到近年来,这项技术已经应用于免疫检测。随着核酸等温扩增技术的发展,有越来越多的检测开始变成纸质化,如RT-RPA,其特别适用于纸张应用,因为其工作温度(37-42°C)不需要大的热能和循环控制。考虑到纸张的化学反应,和扩增试剂的生化复杂性,发生了严重的风险,即当在现场应用实验室开发的方法将失效。在埃博拉病毒(EBOV)的情况下,由于极端的传染风险和约束卫生程序,获得临床样本是非常困难的。通过在几内亚的治疗中心进行操作,研究人员对EBOV感染患者样本进行概念验证测试,从而首次进行评估了基于纸张微流体病毒感染性疾病的NAAT的表现。

即刻使用的微型纸分析装置(μPADs)通过将RT-RPA混合物冷冻干燥在各个纸面上来制备试纸。该实验包括用具有或不具有RNA模板的DNA酶/无RNA酶的蒸馏水将每个试验样品点浸润,在40℃加热该装置并随时间监测荧光信号。所有的纸张设备都具有三个矩形区域,一个为样品点,另外两个为正负对照组。 研究人员构建了一个可移植的设备,已经尽量缩小了体积,以真实环境中进行检测。所有元件都固定在随身携带的手提箱内。敏感摄像头和强大的紫外线灯被简单而小型的USB线性照相机和两个LED所取代。通过使用9层试纸微流体装置可以进行三种感染源的检测。

虽然该方法目前的准确率并不算特别高,未来的持续优化将让该方法变成更可靠更便携更低廉的检测方式,对于不发达国家的大规模的感染性疾病检测具有重要的实际意义。

(信息来源:生物谷)